干细胞外泌体培养过程中，最受关注的问题有哪些？一次性讲明白！

友康生物

2025-03-11

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外泌体作为一种新兴的非细胞疗法，在医疗、美容、科研等多个领域都展现出了巨大的应用潜力。如此火爆的外泌体，在培养过程中却有很多技术挑战，今天我们就来揭开它的神秘面纱，聊聊干细胞外泌体培养过程中的常见问题。

干细胞外泌体培养过程中的常见问题

1、为什么干细胞状态很好，但是外泌体产量却不高？

干细胞状态良好但外泌体产量不高，可能是由培养基、细胞自身、培养条件及操作等多方面原因导致的，主要有以下原因：

（1）外在因素

培养条件问题：培养基成分不合适，如缺乏必要的生长因子，或 pH 值、渗透压偏离适宜范围，会影响外泌体分泌。气体环境不佳，CO₂浓度异常，无法维持稳定 pH 值，也不利于外泌体产生。

培养操作因素：细胞接种密度过高，细胞间竞争营养，代谢废物积累；或密度过低，细胞间相互作用不足，都可能使外泌体产量不高。传代时机把握不好，过早或过晚传代，干扰细胞正常生理节律，影响外泌体分泌功能。

（2）内在因素

细胞特性差异：不同来源的干细胞，如脂肪干细胞、骨髓干细胞，外泌体分泌能力本身存在差异。同一来源干细胞的不同代数，分泌能力也不同，可能传代次数过高，细胞出现老化趋势，影响分泌。

基因表达调控：与外泌体生成、分泌相关的关键基因，如 Rab 蛋白家族基因等表达水平低，即使干细胞整体状态良好，也会导致外泌体生成和分泌受限。

2、如何提高干细胞外泌体的产量？

要提高干细胞外泌体的产量，考虑从这几个方面入手：

①首先是先择合适的培养基，培养基不仅要能够满足干细胞大量增殖的需求，还要有能够促进干细胞在比较合适的条件下大量分泌外泌体的能力。

②其次，选择合适的培养方式，3D培养比2D培养，细胞微环境更接近生理水平，细胞间相互作用更充分，因而收获的外泌体产量更多、质量更高。

③另外，还需要摸索出适合培养体系的培养条件，给干细胞营造优质环境，保障细胞生长与分泌活力。

3、如何保证外泌体的活性？

从细胞培养阶段就要保证细胞的健康状态，因为健康的细胞才能分泌出具有活性的外泌体，因此就要选择一款能够稳定支持细胞传代的培养基，对于预防细胞老化、保障外泌体活力有很大作用。在收集和处理外泌体过程中，要尽量避免高温、剧烈震荡等可能破坏外泌体结构和功能的因素。保存外泌体时，一般需要在低温环境下，如-80℃冰箱，并且可以添加一些保护剂，有助于维持外泌体的活性。

4、如何准确鉴定外泌体？

主要从形态、大小和标志物等方面进行鉴定。形态上，可通过电子显微镜观察，外泌体通常呈杯状或球状；大小方面，利用纳米颗粒跟踪分析技术（NTA）等检测，外泌体的粒径一般在 30-150nm 之间；标志物检测则可以采用蛋白质印迹法（Western blot）检测外泌体表面特异性标志物， CD9、CD63 、CD81中的任意两个需要表达阳性，Alix、Tsg101任意一个表达阳性，Calnexin、histone 3以及GM130任意两个表达阴性，也可以通过流式细胞术对这些标志物进行分析，综合这些方法来准确鉴定外泌体。

5、外泌体在应用时如何确保安全性？

首先要确保外泌体的来源安全，供体细胞应无病原体感染、无遗传缺陷等。在生产过程中，尽量选择无血清的培养体系，避免引入异源成分，严格遵循 GMP 标准，保证生产环境的无菌、无污染，对生产过程中的各个环节进行严格的质量控制和检测，包括对杂质、内毒素等的检测。只有在确保安全有效的前提下，才能将外泌体制剂投入应用。

6、如何降低外泌体培养和制备的成本？

要想降低外泌体制备成本，关键在于以相对较低的价格获得更高的产量，从而以最快速度回本。目前的外泌体培养方式，中小体系一般采用手工培养，大体系采用反应器培养。手工培养难以提高产量，限制了企业快速发展的需求。而大体系的生物反应器，为了保证生产安全、避免污染，往往要搭配自动化产线、自动化的配套清洗设施，这些设施往往价格昂贵、动辄数百万，投入巨大，回本周期过长，给企业造成了巨大的负担。选择中小型的自动化培养设备，可以以一个较低的价格大幅提高外泌体产量，从而快速回本。

友康生物外泌体培养工作站就满足这样的要求。该工作站集成了细胞培养扩增、外泌体生产等关键步骤，整个培养周期15天，使用5L袋装培养基，可得到5L外泌体上清，外泌体收获量达到25万亿，轻松实现产量提升。搭载FEP材质的无菌封闭管路系统，内部预封装无菌片状微载体，即取即用，无需预灭菌。设备及配套管路系统在运行时完全封闭，对设备所处外部环境要求不高，确保培养结果的安全性。它就相当于一个小型的搭配自动化产线的生物反应器，但是比生物反应器价格更低。整体设备高度智能化，细胞接种后无需人工干预，也为我们节省了一定程度的人工成本。

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