细胞冻存的步骤有哪些?

2021-02-02

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细胞冻存是将细胞放在低温环境,减少细胞代谢,以便长期储存的一种技术。细胞冻存是细胞保存的主要方法之一,起到了细胞保种的作用。

屏幕截图 2022-04-25 110009.jpg

下面咱们来了解细胞冻存的步骤有哪些吧!

(一)细胞冻存

1、配制含10%DMSO或甘油、10~20%小牛血清的冻存培养液;

2、取对数生长期的细胞,去除旧培养液,用PBS清洗。

3、去除PBS,加入适量胰蛋白酶(覆盖培养皿表面)把单层生长的细胞消化下来;

4、离心1000rpm,5min;

5、去除胰蛋白酶,加入适量配制好的冻存培养液,用吸管轻轻吹打使细胞均匀,计数,调节冻存液中细胞的最终密度为5×106/ml~1×107/ml;

6、将细胞分装入冻存管中,每管1~1.5 ml;

7、在冻存管上标明细胞的名称,冻存时间及操作者;

8、冻存:标准的冻存程序为降温速率-1~-2℃/ min;当温度达-25℃以下时,可增至-5℃~-10℃/min;到-100℃时,则可迅速浸入液氮中。也可将装有细胞的冻存管放入-20℃冰箱2h ,然后放入-70℃冰箱中过夜,取出冻存管,移入液氮容器内。

(二) 细胞复苏

1、从液氮容器中取出冻存管,直接浸入37℃温水中,并不时摇动令其尽快融化。

2、从37℃水浴中取出冻存管,打开盖子,用吸管吸出细胞悬液,加到离心管并滴加10倍以上培养液,混匀;

3、离心, 1000rpm,5min;4. 弃去上清液,加入含10%小牛血清培养液重悬细胞,计数,调整细胞密度,接种培养瓶,37℃培养箱静置培养;5. 次日更换一次培养液,继续培养。